Выделение, идентификация и филогенетический анализ штамма вируса нодулярного дерматита, полученного от больных мясных коров в Китае

Нодулярный дерматит (НД) крупного рогатого скота, вызываемый вирусом нодулярного дерматита (ВНД, или LSDV), представляет собой высококонтагиозное заболевание, наносящее значительный экономический ущерб животноводству во всем мире. В августе 2019 года LSDV впервые был зарегистрирован в Китае и быстро распространился по стране. Целью данного исследования было выделение, характеристика и филогенетический анализ полевого изолята LSDV/China/HB01/2020, полученного от больных мясных коров в провинции Хубэй. Вирус был успешно выделен на культуре клеток Vero, о чем свидетельствовали характерные цитопатические эффекты (ЦПЭ), обнаружение вирусной ДНК методом ПЦР (ген LSDV132), значительное увеличение числа вирусных копий в ходе количественной ПЦР, а также визуализация типичных кирпичеобразных вирионов с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ). Иммунофлуоресцентный анализ подтвердил специфическое связывание антител из сыворотки переболевших животных с антигенами выделенного вируса.

Полногеномный филогенетический анализ 123 штаммов LSDV из 22 стран мира выявил два основных эволюционных кластера. Изолят LSDV/China/HB01/2020, как и другие китайские штаммы, вошел в состав отдельной ветви, преимущественно состоящей из рекомбинантных вакциноподобных штаммов, циркулирующих в Азии (Китай, Вьетнам, Таиланд, Малайзия, Индонезия). Детальный анализ гена LSDV011 подтвердил событие рекомбинации в геноме исследуемого изолята, где в качестве родительских штаммов выступили V395.1/Бангладеш и LSDV/Россия/Тюмень/2019. Кроме того, в ходе исследования были обнаружены свидетельства рекомбинации между полевыми штаммами LSDV и вирусом оспы коз (GTPV) в азиатском регионе. Полученные данные подчеркивают роль рекомбинационных событий в эволюции вируса и указывают на потенциальные риски, связанные с использованием живых аттенуированных вакцин. Исследование расширяет понимание генетического разнообразия и молекулярной эпидемиологии LSDV в Китае и Азии, что имеет решающее значение для разработки эффективных мер контроля и профилактики нодулярного дерматита.

1. Введение

Нодулярный дерматит (НД) – это острое или подострое контагиозное заболевание крупного рогатого скота, характеризующееся лихорадкой, поражениями кожи, лимфатической системы и слизистых оболочек. Возбудитель – вирус нодулярного дерматита крупного рогатого скота (LSDV) – принадлежит к роду Capripoxvirus семейства Poxviridae, наряду с вирусами оспы овец и оспы коз. Заболевание наносит значительный экономический ущерб из-за снижения молочной и мясной продуктивности, временного или постоянного бесплодия быков, абортов, повреждения шкур, затрат на лечение и карантинные мероприятия.

Основной путь передачи – механический, через кровососущих членистоногих (комары Aedes aegypti, мухи-жигалки Stomoxys spp., клещи). Возможна также прямая передача при контакте с поврежденными кожными поражениями, инфицированными кормами, водой, оборудованием и при неудачных ветеринарных манипуляциях. После первой вспышки в Замбии в 1929 году заболевание распространилось по Африке, а в последние десятилетия – на Ближний Восток, в Европу (Балканы, Россия) и Азию. Всемирная организация здравоохранения животных (WOAH) относит НД к болезням, подлежащим обязательному уведомлению.

В Китае НД был впервые зафиксирован в августе 2019 года в Синьцзяне и в течение короткого времени распространился на многие провинции. Для контроля заболевания широко применяется живая аттенуированная вакцина на основе вируса оспы коз (GTPV). Однако появление в Азии вакциноподобных и рекомбинантных штаммов LSDV вызывает серьезную озабоченность в научном сообществе, поскольку может быть связано с использованием аттенуированных вакцин и указывает на сложные эволюционные процессы.

Целью данной работы было выделение и идентификация полевого штамма LSDV от мясных коров в Китае, его молекулярно-генетическая характеристика, филогенетический анализ и оценка потенциальных рекомбинационных событий для лучшего понимания эпидемиологической ситуации и эволюции вируса в регионе.

2. Материалы и методы

2.1. Клинические образцы и выделение вируса
Образцы кожных узелков были получены от больных мясных коров с типичными клиническими признаками НД на ферме в провинции Хубэй, Китай, в 2020 году. Ткани гомогенизировали в среде DMEM с антибиотиками, центрифугировали и фильтровали через фильтр 0,45 мкм. Супернатант использовали для инокуляции монослоя клеток Vero (линия почек африканской зеленой мартышки), культивируемых в DMEM с 2% эмбриональной телячьей сывороткой (FBS). Культуры инкубировали при 37°C и 5% CO₂, ежедневно наблюдая за появлением цитопатического эффекта (ЦПЭ). После развития выраженного ЦПЭ клетки подвергали трёхкратному замораживанию-оттаиванию, супернатант собирали и использовали для последующих пассажей (всего 7 пассажей). Все работы с инфекционным материалом проводились в лаборатории уровня биобезопасности 3 (BSL-3).

2.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и количественная ПЦР (qPCR)
ДНК экстрагировали из супернатантов инфицированных культур и клинических образцов. Для первичного скрининга использовали ПЦР, нацеленную на консервативный ген LSDV132, в соответствии с китайским национальным диагностическим стандартом GB/T 39602-2020. Для количественной оценки репликации вируса в динамике (через 24, 48, 72, 96 и 120 часов после заражения) проводили qPCR с праймерами к тому же гену. Построение стандартной кривой позволило определить число копий вирусной ДНК.

2.3. Электронная микроскопия
Очищенные методом ультрацентрифугирования вирусные частицы из супернатанта 7-го пассажа анализировали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) для визуализации морфологии вирионов.

2.4. Непрямой иммунофлуоресцентный анализ (нИФА)
Клетки Vero, инфицированные изолированным вирусом, фиксировали через 72 часа после заражения. В качестве первичных антител использовали положительную сыворотку от крупного рогатого скота, переболевшего НД (подтвержденную ИФА и вируснейтрализационным тестом). В качестве вторичных антител применяли анти-бычьи IgG, конъюгированные с флуорохромом FITC. Ядра клеток контрастировали DAPI. Специфическое свечение наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа.

2.5. Секвенирование и филогенетический анализ
Для выделенного штамма LSDV/China/HB01/2020 были амплифицированы, клонированы и секвенированы гены LSDV011, LSDV035 и LSDV074. Эти нуклеотидные последовательности были депонированы в GenBank. Для филогенетического анализа были загружены полные геномные последовательности 123 штаммов LSDV из базы данных NCBI. Множественное выравнивание и построение филогенетических деревьев (метод максимального правдоподобия) проводили с помощью программного обеспечения Geneious Prime.

2.6. Анализ рекомбинации
Потенциальные события рекомбинации в геноме исследуемого изолята, а также между штаммами LSDV и GTPV в Азии, анализировали с использованием программного пакета RDP4 и алгоритмов (RDP, GENECONV, MaxChi, BootScan и др.). Событие считалось достоверным при подтверждении как минимум тремя различными методами (p < 0.05). Для визуализации результатов рекомбинационного анализа использовали программу SimPlot.

3. Результаты

3.1. Выделение вируса и цитопатический эффект
После инокуляции клинического материала в клетки Vero на 3-4 пассаже начал наблюдаться выраженный ЦПЭ, который к 7-му пассажу стал стабильным и отчетливым. Характерные изменения включали округление клеток, их грануляцию, образование синцития (многоядерных клеток) и сетчатой структуры, в конечном итоге приводящие к лизису монослоя. В контрольных (неинфицированных) клетках таких изменений не наблюдалось.

3.2. Молекулярное и серологическое подтверждение
ПЦР с праймерами к гену LSDV132 дала продукт ожидаемого размера (379 п.н.) как для клинического образца, так и для культурального супернатанта. Секвенирование продукта ПЦР показало 100% идентичность с референсными последовательностями LSDV.
qPCR продемонстрировала экспоненциальный рост числа копий вирусной ДНК в зараженных клетках Vero в период с 24 по 96 часов после инфицирования, с пиком на 96 часу, что указывает на активную репликацию вируса.
ПЭМ-анализ подтвердил наличие типичных для поксвирусов крупных (≈290×270 нм) кирпичеобразных или овоидных вирионов.
Непрямой ИФА показал яркую специфическую зеленую флуоресценцию в цитоплазме инфицированных клеток Vero при использовании положительной сыворотки против LSDV, в то время как контрольные клетки не флуоресцировали. Это подтвердило антигенное родство выделенного вируса с полевыми изолятами LSDV.

3.3. Филогенетический анализ полных геномов
Анализ 123 штаммов LSDV со всего мира выявил высокую степень нуклеотидного сходства (98.4–100%). Филогенетическое дерево четко разделило штаммы на две основные клады:

- Клада 1: Включала преимущественно исторические полевые штаммы из Африки, а также штаммы из Европы (Греция, Болгария, Сербия, Россия) и некоторые азиатские изоляты из Индии и Бангладеш.

- Клада 2: Была более разнообразной и подразделялась на две подклады:
Подклада 2.1: Состояла в основном из так называемых вакциноподобных рекомбинантных штаммов, циркулирующих в Восточной и Юго-Восточной Азии (Китай, Вьетнам, Таиланд, Малайзия, Индонезия, Россия/Сибирь).
Подклада 2.2: Включала как дикие, так и вакцинные штаммы из Африки.
Выделенный в данном исследовании штамм LSDV/China/HB01/2020 уверенно вошел в Подкладу 2.1, сгруппировавшись с другими китайскими и азиатскими рекомбинантными изолятами.

3.4. Анализ рекомбинации в гене LSDV011
Детальный анализ гена LSDV011 (кодирующего предполагаемый белок семейства факторов некроза опухоли) штамма LSDV/China/HB01/2020 с использованием алгоритмов RDP4 выявил достоверное событие рекомбинации. Было установлено, что основным родительским штаммом послужил LSDV/Россия/Тюмень/2019, а минорным родительским штаммом – вакциноподобный штамм V395.1 из Бангладеш. Анализ графиков сходства (Similarity Plot) подтвердил наличие двух точек переключения (breakpoints) в положениях 120 и 762 нуклеотида в гене LSDV011, где происходит смена генетического шаблона с одного родителя на другого. Это указывает на то, что китайский изолят является естественным рекомбинантом.

3.5. Рекомбинация между LSDV и GTPV в Азии
При анализе 65 азиатских штаммов LSDV и 13 штаммов вируса оспы коз (GTPV) были обнаружены как минимум два независимых события межвидовой рекомбинации. В одном случае родительскими для изолята LSDV/2021/Banswara (Индия) были определены полевой штамм GTPV из Йемена и китайский штамм LSDV/Xinjiang/2019. Важно отметить, что в этих событиях не участвовал широко используемый в Китае вакцинный штамм GTPV AV41, однако факт рекомбинации между двумя видами каприпоксвирусов подтвержден.

4. Обсуждение

Успешное выделение штамма LSDV/China/HB01/2020 на клетках Vero и его всесторонняя характеристика подтверждают циркуляцию высокоадаптированных к крупному рогатому скоту штаммов вируса в Китае. Полученные результаты находятся в полном соответствии с данными других исследователей, отмечающих активное распространение НД в Азии после 2019 года.

Ключевым выводом работы является подтверждение рекомбинантной природы азиатских штаммов LSDV, включая китайские изоляты. Филогенетический анализ отнес штамм HB01/2020 к отдельной группе вакциноподобных рекомбинантов (Подклада 2.1), что согласуется с гипотезой об их происхождении от живых аттенуированных вакцин, возможно, использовавшихся в регионе (например, вакцины на основе штамма «Lumpivax»). Обнаруженное в гене LSDV011 событие рекомбинации между российским и бангладешским штаммами наглядно демонстрирует механизм генетического обмена, способствующий эволюции и адаптации вируса.

Еще более значимым является факт обнаружения рекомбинации между LSDV и GTPV. Хотя в анализируемых событиях не фигурировал конкретный вакцинный штамм AV41, сама возможность такого генетического обмена между полевыми изолятами двух вирусов представляет серьезную проблему для биобезопасности. Использование живых аттенуированных вакцин против каприпоксвирусов в регионах, где циркулируют несколько видов этих вирусов, может создавать условия для появления новых рекомбинантных вариантов с непредсказуемыми свойствами, включая изменение вирулентности, тропизма или антигенных характеристик.

Эти данные подчеркивают необходимость:

Усиления молекулярно-генетического мониторинга за циркулирующими штаммами LSDV в Китае и соседних странах для оперативного выявления новых генетических вариантов.

Пересмотра стратегий вакцинопрофилактики. Несмотря на эффективность живых аттенуированных вакцин (GTPV или гомологичных LSDV), риски, связанные с рекомбинацией и реверсией вирулентности, стимулируют разработку и внедрение более безопасных платформ, таких как инактивированные, субъединичные или векторные вакцины на основе вируса осповакцины.

Ужесточения контроля за перемещением животных и продуктов животноводства, а также усиления мер по борьбе с насекомыми-переносчиками, особенно в приграничных регионах.

Международного сотрудничества в области обмена генетическими данными и эпидемиологической информацией для отслеживания путей распространения вируса и его эволюции.

5. Заключение

В ходе данного исследования был выделен и охарактеризован полевой штамм вируса нодулярного дерматита LSDV/China/HB01/2020 от мясных коров в Китае. Комплексный анализ подтвердил его принадлежность к группе азиатских вакциноподобных рекомбинантных штаммов. В геноме изолята выявлено событие рекомбинации в гене LSDV011. Кроме того, получены свидетельства межвидовой рекомбинации между полевыми изолятами LSDV и GTPV в Азии. Эти результаты вносят существенный вклад в понимание молекулярной эпидемиологии и эволюционной динамики LSDV в Азиатском регионе и указывают на необходимость разработки новых, более безопасных стратегий контроля нодулярного дерматита, основанных на постоянном мониторинге генетического разнообразия возбудителя.


Исследование: Animal Diseases