Влияние дозы и способа введения вакцины на распространение вируса ЭДС-8 и вызванный им иммунный ответ у экспериментально инфицированного крупного рогатого скота

Вирус эпизоотической геморрагической болезни серотипа 8 (EHDV-8) представляет собой новую угрозу для европейского животноводства. Впервые обнаруженный в Европе осенью 2022 года в Италии, вирус, переносимый мокрецами рода Culicoides, быстро распространился в Испанию, Португалию и Францию. Несмотря на значительные экономические последствия, включающие ограничения на торговлю, знания о патогенезе, тканевой тропичности, персистенции и иммунном ответе на этот серотип у крупного рогатого скота остаются крайне ограниченными. Исторически EHDV у крупного рогатого скота часто протекал субклинически, однако циркулирующие в Европе штаммы демонстрируют изменённую патогенность, приводя к клиническим признакам и потерям. Данное экспериментальное исследование было разработано для изучения динамики инфекции, вызванной испанским изолятом EHDV-8, с акцентом на оценку влияния дозы и способа введения вируса (внутрикожный vs. подкожный) на виремию, распространение вируса в органах и развитие гуморального и клеточного иммунного ответа.

Материалы и методы

В исследовании использовали штамм EHDV-8 SPA 2022/LCV_03. Двенадцать серонегативных бычков голштинской породы в возрасте 6 месяцев были случайным образом разделены на четыре группы по три животных:

1. Группа ID-высокая доза: внутрикожное введение 10⁶·² ТЦД₅₀/животное.

2. Группа SC-высокая доза: подкожное введение 10⁶·² ТЦД₅₀/животное.

3. Группа ID-средняя доза: внутрикожное введение 10⁵·² ТЦД₅₀/животное.

4. Контрольная группа: введение культуральной среды.

Животных содержали в условиях BSL3, ежедневно оценивая клиническое состояние и температуру тела. В течение 21-дневного исследования проводили последовательный отбор проб крови, мазков из носовой и ротовой полостей, а также биоптатов кожи. После эвтаназии отбирали 25 образцов органов и тканей. Вирусную РНК детектировали с помощью панельного RT-qPCR. Инфекционный вирус выделяли на культуре клеток КС. Гуморальный ответ оценивали с помощью коммерческого конкурентного ИФА и теста вируснейтрализации (VNT). Клеточный иммунный ответ (продукция IFN-γ) анализировали с помощью теста высвобождения гамма-интерферона (IGRA) in vitro.

Результаты

1. Клинические признаки и виремия.
Основным клиническим проявлением была лихорадка (≥39.5°C). Продолжительность лихорадочного периода была значимо выше в группах, получивших высокую дозу вируса (ID и SC), по сравнению с группой средней дозы ID (p < 0.05). У одного животного из группы SC-высокая доза, начиная с 10-го дня после заражения (dpi), отмечались апатия, конъюнктивит и увеличение лимфатических узлов. У этого же животного при вскрытии были обнаружены петехии на почках.

Вирусная РНК в крови была обнаружена у всех заражённых животных уже на 3 dpi. Пик виремии пришёлся на 7–10 dpi, без существенных различий в уровне вирусной нагрузки между группами (p = 0.68). Концентрация вирусной РНК в крови постепенно снижалась, но оставалась детектируемой до конца исследования (21 dpi). Инфекционный вирус удавалось выделить из крови преимущественно в период с 5 по 13 dpi.

2. Распространение вируса в тканях и органах.

- Мазки и кожа: Вирусная РНК в мазках из носовой и ротовой полостей обнаруживалась редко и в низких титрах. В биоптатах кожи РНК выявлялась у большинства животных с пиком на 10 dpi, однако вирусная нагрузка была значительно ниже, чем в крови.

- Органы при вскрытии (21 dpi): Наибольшая вирусная нагрузка была обнаружена в лимфатических узлах (среднее Ct = 33.99) и селезёнке (Ct = 31.17). В мышцах, головном мозге и коже концентрации вируса были существенно ниже. Уникальным исключением стала почка клинически больного животного (EHDV04), где значение Ct достигло 20, что указывало на исключительно высокую репликацию вируса в этом органе.

3. Иммунный ответ.

- Гуморальный ответ: Все инфицированные животные сероконвертировались по данным ИФА к 10 dpi. Нейтрализующие антитела также выявлялись с 10 dpi, достигая высоких титров (≥1:2560) к 13 dpi. Ни доза, ни способ введения не оказывали статистически значимого влияния на скорость или силу гуморального ответа.

- Клеточный ответ (IFN-γ): У всех животных, кроме клинически больного (EHDV04), наблюдался чёткий пик продукции IFN-γ в период 5–7 dpi, за которым следовало быстрое снижение. У животного EHDV04 этот пик отсутствовал, а выраженный клеточный ответ был зарегистрирован лишь на 17 dpi, что свидетельствует о задержанном и изменённом клеточном иммунном ответе.

Обсуждение
Проведённое исследование даёт важные новые данные о патогенезе инфекции, вызванной EHDV-8, у крупного рогатого скота. Полученные результаты подтверждают, что данный европейский изолят является вирулентным для крупного рогатого скота, вызывая системную инфекцию с характерной ранней и продолжительной виремией.

1. Ограниченное влияние дозы и пути введения. Несмотря на некоторые различия в продолжительности лихорадки, ключевые параметры инфекции — динамика виремии, время сероконверсии, титры нейтрализующих антител и общая картина распространения вируса в органах — не продемонстрировали существенной зависимости от способа введения (внутрикожный vs. подкожный) или использованной дозы (10⁵·² vs. 10⁶·² ТЦД₅₀). Это позволяет предположить, что оба пути введения эффективно приводят к развитию инфекции, и даже средняя доза достаточна для индукции полноценного иммунного ответа. Однако подкожное введение высокой дозы, по-видимому, может ассоциироваться с риском развития более выраженных клинических проявлений у отдельных особей.

2. Диагностическая значимость. Результаты чётко указывают на то, что кровь является оптимальным образцом для ранней и поздней диагностики методом ПЦР. Для исследований павшего или убитого с диагностической целью скота наиболее информативными образцами являются селезёнка и лимфатические узлы (в частности, предлопаточные), где вирусная нагрузка максимальна. Данные по гуморальному ответу подтверждают высокую эффективность серологических методов (ИФА, VNT) для мониторинга циркуляции вируса.

3. Патогенез и иммунный ответ. Обнаружение исключительно высокой вирусной нагрузки в почках у животного с клиническими симптомами является новым и важным наблюдением, требующим дальнейшего изучения. Это может указывать на тканеспецифическую тропность у некоторых изолятов или на роль индивидуальных факторов хозяина. Нарушенный (задержанный) клеточный иммунный ответ у этого животного позволяет выдвинуть гипотезу о том, что своевременная и эффективная активация клеточного звена иммунитета (пик IFN-γ на 5–7 dpi) играет ключевую роль в контроле над вирусной репликацией и предотвращении развития клинического заболевания. Отсутствие такого раннего ответа может способствовать более широкому распространению вируса в тканях и проявлению симптомов.

4. Практические последствия и будущие направления. Полученные данные имеют практическое значение для совершенствования протоколов эпидемиологического надзора, диагностики и разработки мер контроля. Созданная модель экспериментальной инфекции пригодна для доклинической оценки эффективности и безопасности новых вакцинных препаратов. Однако необходимы дальнейшие исследования на больших группах животных для подтверждения связи между характером клеточного иммунного ответа и исходом инфекции. Также актуальными остаются изучение патогенеза у других восприимчивых видов (овцы, козы) и разработка DIVA-тестов (Differentiating Infected from Vaccinated Animals), которые станут незаменимым инструментом в условиях применения массовой вакцинации.

Заключение
В заключение, инфекция EHDV-8 у крупного рогатого скота характеризуется быстрым развитием виремии, эффективным распространением в лимфоидные органы и мощным гуморальным иммунным ответом. Доза и способ введения вируса оказывают минимальное влияние на эти ключевые параметры, но могут модулировать тяжесть клинических проявлений. Наиболее значимым открытием стала потенциальная роль своевременного клеточного иммунного ответа в контроле над инфекцией. Эти выводы расширяют понимание биологии вновь появившегося EHDV-8 и предоставляют научную основу для разработки комплексных мер противодействия его распространению.

Исследование: Veterinary Research