Скрининг на антитела идентифицирует 78 предполагаемых белков-хозяев, участвующих в заражении или распространении вируса герпеса 3 у обыкновенного карпа, Cyprinus carpio L.


Скрининг на антитела идентифицирует 78 предполагаемых белков-хозяев, участвующих в заражении или распространении вируса герпеса 3 у обыкновенного карпа, Cyprinus carpio L.

Вирус карпового герпеса 3 (CyHV-3) является этиологическим возбудителем серьезного и поддающегося регистрации заболевания, поражающего обыкновенного карпа и карпов кои, Cyprinus carpio L., называемом герпесвирусной болезнью кои (KHVD). За последние 15 лет, с тех пор как из Германии, США и Израиля появились первые сообщения о вирусе CyHV-3, был достигнут значительный прогресс в плане патологии и выявления. Однако было проведено относительно мало исследований, направленных на понимание репликации и распространения вируса. Аффинность на основе антител использовалась для обнаружения CyHV-3 с помощью иммуноферментного анализа и методов, основанных на ПЦР, а иммуногистологические анализы использовались для описания мембранного белка CyHV-3, получившего название ORF81. В этом исследовании моноклональные антитела, связанные с активируемыми N-гидроксисукцинимидом (NHS) вращающимися колонками, использовались для очистки CyHV-3 и белков-хозяев из образцов тканей рыб с симптомами CyHV-3 или без симптомов. Затем образцы анализировали либо методом электрофореза в полиакриламидном геле (PAGE), а затем методом ионизации электрораспылением в сочетании с масс-спектрометрией (ESI-MS), либо методом анализа ESI-MS непосредственно после очистки. В двух анализах было идентифицировано в общей сложности 78 белков-хозяев и пять белков CyHV-3. Эти данные могут быть использованы для разработки новых методов борьбы с CyHV-3, основанных на путях или белках, идентифицированных в этом исследовании.

Вирус карпового герпеса 3 (CyHV-3), ранее известный как вирус герпеса кои (KHV), является этиологическим возбудителем серьезного и поддающегося регистрации заболевания, поражающего обыкновенного карпа и карпов кои, Cyprinus carpio L., называемого герпесвирусной болезнью кои (KHVD), и он распространился через торговлю карпом и выставки кои. CyHV-3 был выделен из почек, жабр, селезенки, кишечника, печени и мозга мертвой рыбы и вызывает высокий уровень смертности, от 80 до 100%. Наиболее распространенными клиническими признаками заболевания являются белые пятна, запавшие глаза, увеличение селезенки и почек и некроз жабр у инфицированных рыб. Известно, что CyHV-3 поражает карпа при температуре от 15 до 25 °C. Геном CyHV-3 состоит примерно из 295 тысяч пар оснований (т.н.), кодирующих 156 новых предполагаемых белков.

В нескольких исследованиях использовалась иммунохимия, которая использует преимущество аффинности, основанной на авидности антител к антигену, в исследованиях CyHV-3. В недавнем исследовании для выявления вируса использовались поликлональные антитела против CyHV-3, и этот метод может быть более чувствительным, чем другие традиционные методы, основанные на ПЦР. Для обнаружения CyHV-3 был разработан чувствительный иммуноферментный анализ (ELISA) Адкинсоном, Ореном и Хендриком (2005), и другое моноклональное антитело против ORF68 также было разработано Aoki et al. Другое моноклональное антитело, полученное против ORF81, локализуется в цитоплазматических областях клеток, включая эндоплазматический ретикулум или аппарат Гольджи, вероятно, во время синтеза белка, и в вирусной оболочке у зрелых особей.

Знания о белковых взаимодействиях могут быть использованы для понимания того, как вирусы проникают в клетки-хозяева и размножаются во время инфекции. Хотя были идентифицированы некоторые гены, отвечающие за поддержание и репликацию CyHV-3, мало что известно о белковых взаимодействиях при распространении вируса и еще меньше известно о том, взаимодействует ли этот вирус с какими-либо эндогенными белками обыкновенного карпа. В недавнем отчете использовались электрофорез в полиакриламидном геле (СТР.) и методы химической очистки белка для идентификации 40 белков CyHV-3, включенных в зрелые вирусы. В ходе исследования также были идентифицированы восемнадцать белков рыбы, включая один белок обыкновенного карпа. Хотя был описан ряд методов очистки белка, очистка с помощью авидности на основе антител является мощным методом выявления партнеров по связыванию с белками in vivo.

Во время масс-спектрометрии образцы ионизируются и фильтруются в зависимости от массы, заряда и формы, а затем детектор измеряет отношение массы образца к заряду. Анализ образцов, содержащих полимеры, пептиды и белки с молекулярной массой более 20 кДа, с использованием источника ионизации электрораспылением в сочетании с четырехкратным масс-спектрометром (ESI-MS), был впервые предложен Фенном и др. (1989). С тех пор ESI-MS превратился в чувствительный инструмент для обнаружения образцов с фемтомолярными концентрациями в наномольных количествах и обычный метод характеристики нелетучих и термолабильных биомолекул, которые не поддаются анализу другими традиционными методами. За последнее десятилетие ESI-MS стала важным методом в протеомике для подтверждения аминокислотной последовательности и характеристики посттрансляционных модификаций. Мы использовали очистку антител в сочетании с анализом ESI-MS для выявления новых белков, которые могут быть использованы в качестве потенциальных мишеней для ингибирования репликации CyHV-3.

Материалы и методы

Образцы рыб

В качестве образцов с бессимптомным течением CyHV-3 были использованы две естественно инфицированные рыбы, у которых наблюдались признаки тяжелого некроза жабр и кожи, а также выпадение слизи на коже. В качестве контроля использовалась одна рыба, у которой отсутствовали какие-либо признаки CyHV-3.

Подготовка тканей

Экстракты тканей (объединенные из жабр, печени, почек, селезенки и головного мозга) были отдельно отобраны в асептических условиях у двух разных карпов с симптомами CyHV-3 и у одного карпа кои с бессимптомным течением, и образцы были отдельно гомогенизированы в минимально необходимой среде. Часть каждого гомогената использовали для извлечения ДНК с использованием набора для анализа тканей крови DNeasy (Qiagen) в соответствии с инструкциями производителя. Другая аликвота гомогената использовалась для размножения CyHV-3 на линии клеток мозга обыкновенного карпа (CCB). Выделенную ДНК подвергали обычной ПЦР в соответствии с Bercovier et al. (2005) и ПЦР в реальном времени в соответствии с Gilad et al. (2004). CyHV-3 из рыбы с симптомами был успешно размножен на клетках CCB и впоследствии подтвержден ПЦР-амплификацией целевых сегментов ДНК обычным методом (рис. 1) и ПЦР в реальном времени, как описано ранее. Однако ни обычная ПЦР, ни ПЦР в реальном времени не выявили CyHV-3 в образце рыбы с бессимптомным течением. Оставшиеся аликвоты отдельно использовали для приготовления тканевого лизата для масс-спектрометрического анализа методом электрораспылительной ионизации (ESI-MS).


ПЦР-анализ образцов инфицированной рыбы. Полоса 1: экстракт ДНК рыбы с симптомами, который позже был использован для PAGE и последующего анализа ESI-MS. Полоса 2: экстракт ДНК рыбы с симптомами, который позже был использован непосредственно для анализа ESI-MS. Полоса 3: пуста. Полоса 4: экстракт ДНК бессимптомной рыбы, который позже был использован непосредственно для анализа ESI-MS. Полоса 5: пусто. Полоса 6: экстракт ДНК из положительного контроля CyHV-3. Полоса 7: пуста. К полосам 1-7 добавлено пятнадцать микролитров образца. Полоса 8: 1 мкл лестничной ДНК Bio-Rad объемом 1 кб.


Получение тканевого лизата

Каждый гомогенат с предыдущего этапа лизировали отдельно в соотношении 1:1 с неденатурирующим буфером для лизиса: 50 мм трис-HCl (рН 8,0), 150 мм NaCl, 20 мм этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 1% Na–дезоксихолата, 1% Triton X-100 (Williams 2000) и коктейль ингибиторов протеазы (50 мкл--1 лизирующего буфера). Затем каждый лизат интенсивно перемешивали и центрифугировали при 16 000 g в течение 15 минут. Надосадочную жидкость переносили в свежую пробирку Эппендорфа объемом 1,5 мл и повторно центрифугировали при 16 000 g в течение дополнительных 15 минут. Супернатант от второго центрифугирования для каждой фракции отдельно использовали для аффинной очистки, как описано в следующих разделах.

Подготовка спиновых колонок, связанных с моноклональными антителами

Моноклональные антитела против гликопротеина CyHV-3 конъюгировали с активированной N-гидроксисукцинимидом (NHS) агарозной вращающейся колонкой емкостью 33 мг (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с инструкциями производителя. Вкратце, 50 мкл моноклонального антитела CyHV-3 ресуспендировали в 350 мкл физиологического раствора с фосфатным буфером (PBS): 13,7 мм NaCl, 0,27 мм KCl, 10 мм Na2HPO4, 0,2 мм KH2PO4, рН 7,4 для получения общего раствора 400 мкл и выдерживали в течение ночи при температуре 4 °C при легком встряхивании со скоростью 300 об/мин в термосмесителе Eppendorf Comfort. Колонки для отжима опорожняли и дважды промывали PBS после ночной инкубации при 4° C с легким встряхиванием. Затем вращающиеся колонки охлаждали 400 мкл 1 м этаноламина (рН 7,4) путем инкубации в течение 1 ч при 4°C с легким встряхиванием. Наконец, вращающиеся колонки опорожняли центрифугированием при 16 000 g в течение 30 с и шесть раз промывали PBS, и оптическая плотность при 280 (OD280) конечной проточной жидкости была нулевой.

Очистка белка

Неденатурированные цельноклеточные экстракты из образцов тканей CyHV-3, полученных как от рыб с симптомами, так и от бессимптомных рыб, отдельно инкубировали в течение ночи при 4 ° C с легким встряхиванием при 300 об/ мин в вращающихся колонках, связанных моноклональными антителами (описано ранее). Затем вращающиеся колонки очищали, а проточный материал сохраняли для гель-электрофореза. Колонки для отжима восемь раз промывали PBS, и OD280 конечного пропускания был равен нулю. Затем спиновые колонки элюировали 500 мкл 0,1 м глицина (рН 3,0) путем инкубации при легком встряхивании в течение 1 часа при 4°C, и рН немедленно нейтрализовали добавлением 50 мкл 1 м основания Трис (рН 8,0). Колонки немедленно промывали PBS, и как элюат, так и первую промывную фракцию концентрировали с использованием сухого вакуумного концентратора (Eppendorf) до конечного объема 55 мкл. Затем образцы либо анализировали методом ESI-MS, либо дополнительно концентрировали до 10 мкл и анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE).

SDS-СТРАНИЦА

10 мкл концентрированной пробы смешивали с 10 мкл буфера для образцов 2× Laemmli (100 мм трис–HCl, рН 6,8, 200 мм 2-меркаптоэтанола, 4% SDS, 0,2% бромфенолового синего, 20% глицерина) и нагревали при 99°C при легком встряхивании (300 об/мин) в течение 10 минут. Белки были разделены в 12% полиакриламидном рассасывающем геле и 5% укладывающем геле, приготовленном в соответствии с Sambrook & Russell 2001). Гели прогоняли с использованием мини-протеиновой установки Tetra Cell (Bio-Rad laboratories GmbH) при 120 В в течение 70 мин в 1× буферном растворе (25 мм Трис, 250 мм глицина, рН 8,3, 0,1% SDS). Загрузка геля была одинаковой для всех лизатов. Белки визуализировали окрашиванием Coomassie Brilliant Blue R-250 (Sigma-Aldrich). Для оценки молекулярной массы выделенных белков использовали неокрашенный белковый маркер II ProSieve в широком диапазоне (10-200 кДа) (Lonza), который содержит 11 полос, 10, 15, 20,30, 40, 50, 70, 100, 120, 150 и 200 кДа.

Масс-Спектрометрический анализ методом электрораспылительной ионизации (ESI-MS)

После окрашивания синим Кумасси гель ПЕЙДЖА разрезали в местах, соответствующих областям, где визуализировались интересующие полосы, и отправили на ионизацию электрораспылением в сочетании с масс-спектрометрическим анализом (ESI-MS). Другие образцы, которые состояли из полностью очищенных от антител продуктов, полученных от рыб с симптомами или бессимптомно протекающих заболеваний, также были отдельно проанализированы ESI-MS. Масс-Спектрометрический анализ методом электрораспылительной ионизации был выполнен DKFZ, Немецким центром исследований рака при Ассоциации Гельмгольца (Гейдельберг, Германия).

Результаты

Очистка белка и гель- электрофорез

Для анализа белков-хозяев и вирусных белков, участвующих в заражении CyHV-3, использовалась аффинная очистка белка. Образцы тканей, полученные от рыб с симптомами CyHV-3 и без симптомов, были обработаны моноклональными антителами против CyHV-3, конъюгированными со спиновыми колонками (как описано в Материалах и методах). Два образца с симптомами были элюированы с соответствующими оптическими плотностями 0,264 и 0,552 при 280 (OD280). После концентрирования OD280 образцов был выше 3,0. Третий образец, полученный от бессимптомных и отрицательных по ПЦР рыб, также был очищен, и элюат имел OD280, равный 0,012. Образец с исходным OD 0,264 был проанализирован с помощью электрофореза в полиакриламидном геле на основе додецилсульфата натрия (SDS-PAGE). Была визуализирована одна полоса, соответствующая ~ 10 кДа, и другая полоса, соответствующая ~60 кДа (рис. 2).


СТРАНИЦА анализ иммунопреципитации. Использовалась полоса 1: 5 мкл неокрашенного маркера белка ProSieve II (фирмы Lonza), 10-200 кДа, которая состоит из 11 полос: 10, 15, 20, 30, 40, 50, 70, 100, 120, 150 и 200 кДа. Уровни 120, 150 и 200 кДа плохо разделялись и представляли собой 1 полосу. Полоса 2: пропускание неденатурированного лизата (см. Методы). Полоса 3: Пептиды, очищенные моноклональными антителами. Наблюдаются две полосы: одна с ~ 10 кДа, а другая полоса, соответствующая ~ 60 кДа. Полоса 4: Первая промывка фосфатно-буферным физиологическим раствором после элюирования глицином (рН 3,0). Сорок микролитров соответствующих образцов прогоняли по полосам 2-4.


Анализ ESI-MS
Два отдельных образца очищенных от моноклональных антител CyHV-3 образцов ткани CyHV-3, полученных от рыб с симптомами, и образец ткани, полученный от рыб с бессимптомными и ПЦР-отрицательными результатами, были проанализированы методом электрораспылительной ионизации в сочетании с масс-спектрометрическим анализом (ESI-MS).

Первый образец, у которого после очистки исходный OD280 равнялся 0,264, состоял из двух срезов, на которых были видны полосы в геле, окрашенном Кумасси, как описано ранее. Другой образец, у которого после очистки исходный OD280 равнялся 0,552, был проанализирован без каких-либо изменений, за исключением концентрации. Два анализа выявили в общей сложности пять белков CyHV-3, два из которых перекрывались (40%), и в общей сложности 78 белков карпа, 28 из которых перекрывались (36%). В образце, взятом от бессимптомной рыбы, был идентифицирован только один CyHV-3 в сочетании с 12 идентифицированными белками карпа, из которых восемь (66%) были идентичны тем, которые были идентифицированы при разделении геля.

Выделение геля В образце для разделения геля 56 белков были идентифицированы с помощью анализа ESI образцов тканей, очищенных от моноклональных антител к CyHV-3, полученных от рыб с симптомами CyHV-3. Были идентифицированы два белка CyHV-3: основной капсидный белок и гликопротеин (таблица 1a). Остальные 54 белка, соответствующие белкам, происходящим от карпа, были классифицированы на семь различных групп (таблица 2a). Пять белков карпа или их гомологи были ранее идентифицированы в Michel et al. (2010) отчет, совместно с бета-актином, который был сгруппирован с тремя другими белками цитоскелета. Также были идентифицированы семь белков, участвующих в регуляции защиты хозяина в дополнение к 12 белкам, которые участвуют в модификации белка. Также были идентифицированы пятнадцать белков, содержащих гем, в сочетании с тремя трансферринами, а остальные восемь белков не были классифицированы.

Белки CyHV-3 идентифицированы с помощью анализа ESI-MS
Регистрационный номер.
Описание белкаОценкаМасса [Да]МатчиОхват [%]
(а) Два белка CyHV-3, идентифицированные с помощью анализа eiectrospray из срезов gei, полученных из образцов рыбы с симптомами
gi|65306693Основной капсидный белок [вирус карпового герпеса 3]27814043774.8
gi|129560573Гликопротеин [вирус карпового герпеса 3]4310071022
(b) Пять белков CyHV-3, идентифицированных методом электрораспылительного анализа из немодифицированного раствора лизата, полученного в образцах рыбы с симптомами
gi|61696095Основной капсидный белок [вирус карпового герпеса 3]2514043610.9
gi|l29560573Гликопротеин [вирус карпового герпеса 3]2410071010.9
gi|l295606690RF150 [Вирус карпового герпеса 3]237051511.1
gi|l318400520RF22 [Вирус карпового герпеса 3]226756311
gi|l31840053ORF23 [Вирус карпового герпеса 3]263880812.1
(c) Один белок CyHV-3, идентифицированный методом электрораспылительного анализа из немодифицированного раствора лизата, полученного у бессимптомных рыб.
gi|129560573Гликопротеин [вирус карпового герпеса 3]2410071011.1

CyHV-3, вирус карпового герпеса 3

Таблица 2

Cyprinus carpio белки, идентифицированные с помощью анализа ESI-MS

Регистрационный номер.Описание белкаОценкаМасса [Да]МатчиОхват [%]
(а) Пятьдесят четыре C. carpio белков, идентифицированных методом электрораспылительного анализа из срезов геля, полученных из образцов рыбы с симптомами, сгруппированных в 7 вышеупомянутых категорий
gi|28628941Фактор удлинения 1-альфа12850 32536.1
gi|l7369826Цепь лактатдегидрогеназы А.11536 53925.4
gi|l5628189Белок теплового шока 90 альфа2825 33615.3
gi|l4388583Белок 65 кДа, связанный с акклиматизацией при высоких температурах7850 64036.6
gi|218511593RAB8A2323 823105.3
Белки цитоскелета
gi|42560193Бета-актин49642 0682425.1
gi|1703140Альфа-актин-132642 2741418.8
gi|13365501Цепь интегрина бета-217387 59757.3
gi|6226787Виментин5652 51643.5
Защитные белки хозяина
gi|4126587Комплемент C3-H1223184 98564
gi|9453863Комплемент C4-167193 00410.8
gi|9453865Комплемент C4-298194 64331.9
gi|3399699Естественный фактор усиления клеток- киллеров4422 41015.5
gi|297718575Гранзим A / K2629 14924.3
gi|7939556Лизоцим С4917 241211.7
gi|2829695Гранулин-3476995224.6
Ферменты или ингибиторы модификации белка
gi|439153Ингибитор сериновой протеазы28845 9601213.4
gi|416561Гомолог альфа-1-антитрипсина37242 0442223.7
gi|56709493Предполагаемая глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа2133 54022.2
gi|4027925Креатинкиназа M1-CK3742 98013.4
gi|73762632Карбоангидраза8028 716311.9
gi|373503076глутаматдегидрогеназа91054 7504647.1
gi|112901127Глутатион-S-трансфераза rho3526 70016.6
gi|152925970Слитый белок убиквитина27914 9871941.4
gi|91798526Субъединица активатора протеасомы PA283728 57912.8
gi|217272706Моноаминоксидаза44259 6211316.3
gi|6690508Janus kinase 322131 07810.7
gi|300676317Каталаза2149 18713.1
Глобины
gi|2208883Альфа-глобин52915 4213552.4
gi|2208891Альфа-глобин48815 5663554.5
gi|2208889Альфа-глобин39015 5742861.5
gi|122392Альфа-глобин59515 4374562.2
gi|6009727Альфа-2-макроглобулин-1631162 2742211.8
gi|6009729Альфа-2-макроглобулин-2541157 8761810
gi|6009731Альфа-2-макроглобулин-343488 2971415.1
gi|140368180Альфа-2-макроглобулин 4368101 3401211.4
gi|22135548Бета-глобин58416 5204163.3
gi|2208895Бета-глобин73216 6176787.2
gi|1644253Бета-глобин71816 6456387.2
gi|1644251Бета-глобин70616 5426887.2
gi|3953518Тяжелая цепь иммуноглобулина105350 3315447.6
gi|55700034Тяжелая цепь иммуноглобулина7840 300406.4
gi|85067845Изоформа миоглобина 22916 278105.4
Трансферрины
gi|18034630Вариант трансферрина A188275 59510047.1
gi|189473163Вариант трансферрина F98675 0364526
gi|189473165Вариант трансферрина G100375 0834726.9
Неклассифицировано
gi|29501366Короткая форма фетуина4334 33227
gi|13445027Аполипопротеин A-I8320 797416.1
gi|435737Глиальный фибриллярный кислый белок11924 944699.3
gi|151558991Вителлогенин B12221148 68310039.6
gi|52782167Вителлогенин B2964179 6404813.4.
gi|14009437Митохондриальная АТФ - синтаза3259 69912.2
gi|47605558Субъединица бета митохондриальной синтазы7155 32724.1
gi|10566900Миелоидный белок-13517 84917.5
(b) Пятьдесят два C. carpio белков, идентифицированных методом электрораспылительного анализа из немодифицированного раствора лизата, полученных из образцов рыбы с симптомами, сгруппированных в 7 вышеупомянутых категорий
gi|28628941Фактор удлинения 1-альфа9750 32556.7
gi|l7369826Цепь лактатдегидрогеназы А.11036 53926.3
gi|55669145Субъединица лактатдегидрогеназы B-типа15036 66939
gi|33598990Конститутивный белок теплового шока HSC70-232970 7791212.3
gi|218511593RAB8A2623 82315.3
Белки цитоскелета
gi|42560193Бета-актин45742 0681524.8
gi|6226787Виментин12752 51663.5
Защитные белки хозяина
gi|4126587Комплемент C3-H1362184 98595.2
gi|4126593Комплемент C3-S179185 56152.9
gi|3399699Естественный фактор усиления клеток- киллеров9322 41039.5
gi|84569882Естественный фактор усиления клеток- киллеров25122 0141047.7
gi|165880803MIF2612 525114.1
gi|47117021Лизоцим g8820 425310.8
Ферменты или ингибиторы модификации белка
gi|439153Ингибитор сериновой протеазы8345 96029
gi|416561Гомолог альфа-1-антитрипсина26142 044715.6
gi|56709493Предполагаемая глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа14633 54029.2
gi|4027925Креатинкиназа M1-CK3442 98011.6
gi|73762632Карбоангидраза28528 716740.4
gi|373503074глутаматдегидрогеназа6354 73723.1
gi|112901127Глутатион-S-трансфераза rho5126 70014.4
gi|95832156Глутатион S-трансфераза класса Pi6923 794210.1
gi|300676299Глутатионпероксидаза 13719 182110
gi|343481094Глутатионсинтетаза2241 34212.5
gi|353351682Трипсин 111426 94016.6
gi|117518748Енолаза2116 20614.1
Глобины
gi|2208891Альфа-глобин52715 5664473.4
gi|2208883Альфа-глобин49415 4213569.2
gi|2208887Альфа-глобин49215 4493669.2
gi|2208889Альфа-глобин37215 5742469.2
gi|122392Альфа-глобин65915 4375681.1
gi|1644251Бета-глобин65216 5424778.4
gi|2208895Бета-глобин56816 6174670.9
gi|22135548Бета-глобин48516 5202654.4
gi|3953518Тяжелая цепь иммуноглобулина17750 331512.8
gi|85067845Изоформа миоглобина 28616 278212.9
Трансферрины
gi|18034630Вариант трансферрина A42075 5951712.3
gi|189473165Вариант трансферрина G32175 0831210.2
Неклассифицировано
gi|29501366Короткая форма фетуина6434 33237.3
gi|13445027Аполипопротеин A-I22620 797732.2
gi|435737Глиальный фибриллярный кислый белок41724 9444128
gi|435739Глиальный фибриллярный кислый белок50424 5314433.2
gi|49356890Нейротрофический фактор, происходящий из глии2511 00418.6
gi|2252655Предшественник нефрозина34031 6291327.5
gi|281333450Белок, связывающий жирные кислоты сердечного типа15614 704521.8
gi|15778562Вителлогенин294148 794127.8
gi|84569880Опухолевый белок , контролируемый трансляцией8419 15228.2
gi|281429776Белок, связывающий жирные кислоты в адипоцитах12415 278216.4
gi|1173446Соматолиберин284976117.8
gi|585105Эпендимин38524 4336741.9
gi|40549335Цитохром P4501C12459 58311.3
gi|219935425Минералокортикоидный рецептор24107 38010.5
gi|169674670Основной белок b, связывающий жирные кислоты с печенью2414 255115.9
(c) Двенадцать белков C. carpio, идентифицированных методом электрораспылительного анализа из немодифицированного раствора лизата, полученных из образцов рыбы с бессимптомным течением, сгруппированных в 7 вышеупомянутых категорий
gi|32394421Мышечно-специфический белок теплового шока Hsc70-15170 66026.1
Белки цитоскелета
gi|42560193Бета-актин7842 06848.9
gi|1703140Альфа-актин-17742 27439
gi|6226787Виментин3252 51611.5
Защитные белки хозяина
gi|7939556Лизоцим С26417 2412043.4
gi|313509543Toll-подобный рецептор 2230109 13630.7
gi|2829694Гранулин-2437215117.5
Ферменты или ингибиторы модификации белка
gi|152925970Слитый белок убиквитина9914 987524.2
Глобины
gi|122392Альфа-глобин8815 437416.1
gi|85067845Изоформа миоглобина 22516 27815.4
Неклассифицировано
gi|435737Глиальный фибриллярный кислый белок8024 944305.1
gi|162423638Циклин B2745 06812

MIF, фактор, ингибирующий миграцию.

54 и 52 идентифицированных белка либо из срезов геля, либо из немодифицированных образцов, соответственно, были разделены на семь групп, которые включают: цитоскелетные, защита хозяина, модификация или ингибиторы белка, глобины, трансферрины, неклассифицированные. Белки, обнаруженные в обоих анализах, выделены жирным шрифтом.

В растворе Второй образец, который имел исходный OD 0,552 при 280, был проанализирован непосредственно с помощью ESI-MS, и было идентифицировано 57 белков. В дополнение к двум белкам CyHV-3, идентифицированным в предыдущем разделе, были идентифицированы три дополнительных белка CyHV-3: ORF22, ORF23 и ORF150 (Таблица 1b). Дополнительно было идентифицировано 52 белка карпа, которые были классифицированы на семь различных групп, как в предыдущем разделе (таблица 2b). Аналогичным образом, пять белков карпа или их гомологи были ранее идентифицированы в Michel et al. (2010) в сочетании с бета-актином, который был сгруппирован с виментином, другим белком цитоскелета. Также были идентифицированы шесть белков, участвующих в регуляции защиты хозяина в дополнение к 12 белкам, которые участвуют в модификации белка. Также были идентифицированы десять белков, содержащих гем, в сочетании с двумя трансферринами, а остальные 15 белков не были классифицированы.

Группа рыб с бессимптомным течением Третий образец, который состоял из очищенных от моноклональных антител к CyHV-3 образцов тканей, полученных от рыб с бессимптомным CyHV-3, выявил только один белок CyHV–3, гликопротеин ORF56 (таблица 1c) и 12 белков карпа, которые включают один гомолог к исследованию Michel et al. (2010), три белка цитоскелета, два белка хозяина. связанные с защитой белки, один белок, участвующий в модификации белка, два белка, содержащих гем, и три неклассифицированных белка (2c).

Обсуждение

Важность понимания протеомики, такой как межбелковые взаимодействия, является фундаментальной для понимания биологических систем (Watson James 2003). В сочетании с традиционными инструментами, используемыми для описания белковых взаимодействий, такими как иммунохимия и двухгибридная система дрожжей, масс-спектрометрический анализ стал очень полезным инструментом для изучения белковых взаимодействий (Cameron 2012). Мы использовали очистку на основе антител в сочетании с масс-спектрометрией для выявления белковых мишеней при заражении вирусом герпеса 3 у карпа, что в конечном итоге может быть использовано для разработки новых методов контроля CyHV-3 у кои и карпа обыкновенного. В ходе этого исследования у рыб, больных CyHV-3, были идентифицированы 78 белков-хозяев, участвующих в заражении или распространении вируса карпового герпеса 3, и пять потенциальных иммуногенных белковых мишеней CyHV-3. Кроме того, четыре белка-хозяина были идентифицированы у рыб с бессимптомным течением CyHV-3. Основной капсидный белок, идентифицированный в этом исследовании, соответствует ORF92, ранее идентифицированному в Michel et al. (2010); однако остальные четыре белка, ORF22, ORF23, гликопротеин (ORF56) и ORF150, ранее не были обнаружены. Чтобы улучшить наше понимание белков CyHV-3, см. (Sigrist et al. 2010) и Simple Modular Architect Research Tool (SMART) от Letunic, Doerks & Bork (2012) были использованы для выяснения важных доменных структур из пяти идентифицированных CyHV-3 белков (таблица 3).

Мы сравнили белки, идентифицированные при этой очистке, с белками, идентифицированными Michel et al. (2010), чтобы оценить достоверность нашего анализа. Сравнение затруднено, поскольку набор данных, использованный в предыдущем исследовании, был составлен до того, как был доступен весь геном C. carpio, и, следовательно, все белки (фактор элонгации), перечисленные в предыдущем отчете, кроме одного, получены либо от рыбы-зебры, Danio rerio, либо от атлантического лосося, Salmo salar. Однако два белка (фактор элонгации и лактатдегидрогеназа) были идентичны белкам, идентифицированным в вышеупомянутых исследованиях. Rab8a также был включен в качестве совпадающего из-за высокой гомологии последовательностей среди белков семейства Rab (Bright et al. 2010). Аналогичная логика использовалась для включения белков теплового шока в число белков, также идентифицированных в исследовании Michel et al. (2010). Хотя глутатион-S-трансфераза rho была идентифицирована в обоих изолятах и является белком, связанным с ras, она не была включена в список Michel et al. (2010), поскольку выравнивание ClustalW не показало значительной гомологии между двумя белками. Интересно, что в нашем исследовании было идентифицировано несколько белков цитоскелета, включая актин (Хозейн и др. 2003; Williams et al. 2006) и виментин, а в исследовании Michel et al. (2010) также были идентифицированы белки цитоскелета, которые включают два вездесущих динамических белка цитоскелета тубулин и актин (Gavin 1997), и кофилиноподобный белок, который может действовать как регулятор динамики актина (De La Круз, 2009; Шиозаки и др. 2009).

Электрораспылительный анализ образцов, взятых у рыб с симптомами, выявил семь белков при анализе в геле и шесть белков при анализе в растворе, которые участвуют в пути защиты хозяина. Два белка, природный фактор усиления клеток-киллеров (Fujiki et al. 1999) и комплемент C3-H1 (Nakao et al. 2000), были обнаружены в каждом из двух образцов, полученных от рыб с симптомами; таким образом, всего было идентифицировано 11 белков. В дополнение к белку C3-H1, три других белка (комплементы C3-S, C4-1 и C4-2) были идентифицированы в пути защиты комплемента хозяина (Като и др. 2004). Из оставшихся пяти белков защиты хозяина гранзим A/K является членом семейства сериновых протеаз (Хуанг и др. 2010) наряду с фактором усиления естественных клеток-киллеров, который является компонентом естественных клеток-киллеров, а фактор ингибирования миграции макрофагов (MIF) является членом сигнального пути цитокинов (Бернхаген и др. 1993). Белкорт и др. (1995) продемонстрировали, что гранулин-1 локализуется в макрофагах у обыкновенного карпа и золотой рыбки, Carassius auratus auratus и гранулин-3, который был идентифицирован при анализе геля, также, вероятно, является частью пути защиты хозяина. В этом анализе также были идентифицированы лизоцим С и лизоцим G; Кластерное выравнивание не выявило существенной гомологии между двумя белками и филогенетически не связано (Savan, Aman & Sakai 2003). Сверхэкспрессия эндогенного лизоцима С обладает антимикробной и противовирусной активностью в морских окунях, Epinephelus coioides, клетках селезенки (Wei et al. 2012). Хотя лизоцим С и лизоцим G имеют очень низкую гомологию последовательностей у белого амура, Ctenopharyngodon idellus, они имеют схожие профили экспрессии, и было показано, что оба обладают антимикробной активностью, что может указывать на то, что лизоцим G также обладает противовирусной активностью, что согласуется с предыдущим исследованием (Ye et al. 2010).

Модификация белка является последним методом регуляции белка, таким как модификация регуляции генов с помощью гистонового кода; убиквитиновый код и другие модификаторы белков используются для активации, подавления, нацеливания, стабилизации или разложения белков. В этом исследовании было идентифицировано всего 17 белков, участвующих в модификации белка. Семь белков перекрывались как при анализе геля, так и немодифицированного раствора. В растворе геля были идентифицированы два участника пути деградации белка, белок слияния с убиквитином и субъединица активатора протеасомы, и, соответственно, один из идентифицированных белков CyHV-3 (таблица 3a) имеет домен БЕЗЫМЯННОГО пальца, который, как известно, опосредует активность убиквитинлигазы E3.Таблица 2a) ). Оба анализа выявили глутатион-S-трансферазу rho; кроме того, в немодифицированном растворе были также идентифицированы четыре других белка, связанных с глутатионом (таблица 2b), и известно, что эти белки регулируют воспалительную реакцию и модулируют белки цитоскелета (Zhang et al. 1995). Интересно, что гомолог альфа-1-антитрипсина был идентифицирован в обоих анализах, а трипсин 1 был идентифицирован в необработанном образце; можно задаться вопросом, модулируется ли взаимодействие этих белков при заболевании CyHV-3.

Вирус карпового герпеса 3 также известен как KHV, который когда-то называли вирусом интерстициального нефрита и некроза жабр карпа (CNGV), потому что первоначально было описано, что заболевание поражает почки и жабры. В последнее время ведутся споры о том, является ли кожа, особенно в местах истирания, местом проникновения вируса. Однако нам неизвестно об исследовании, в котором описывается, как вирус распространяется на другие основные органы, такие как печень, селезенка и головной мозг. Обилие связанных с кровью белков, таких как глобины и трансферрины, может навести на мысль о том, распространяется ли CyHV-3 через систему транспорта крови.

В несекретном списке в общей сложности был сгруппирован 21 белок. В обоих анализах были идентифицированы три белка, раствор геля содержал дополнительные шесть белков, а немодифицированный раствор содержал дополнительные 12 белков (таблица 3). Известно, что CyHV-3 поражает почки, селезенку и мозг карпа было идентифицировано несколько белков, которые локализуются в областях, пораженных CyHV-3, включая предшественник нефроза, короткую форму фетуина и три других глиально-ассоциированных белка.

Первоначальные попытки контролировать вспышки CyHV-3 были предприняты путем кратковременного воздействия CyHV-3 при допустимой температуре (т.е. 15-25 °C) и последующей обработки при недопустимой температуре (30 °C) для стимуляции иммуногенного ответа против CyHV-3 (Ронен и др. 2003). Однако несколько исследований показывают, что CyHV-3 остается в состоянии покоя у выживших после заболевания CyHV-3 и что CyHV-3 может даже всплывать на поверхность для распространения и заражения наивных рыб. Третий образец, который был проанализирован, был получен от рыбы без признаков заболевания CyHV-3 и не содержал CyHV-3 согласно анализу с помощью обычной ПЦРи ПЦР в реальном времени; однако ESI-MS обнаружила гликопротеин (ORF56), что указывает на то, что образец может быть заражен вирусом CyHV-3. были латентными носителями заболевания CyHV-3 (таблица 1c). Интересно, что у бессимптомного носителя были идентифицированы четыре новых белка в сочетании с 8 белками, идентифицированными ранее. Четыре новых белка включают дополнительный гомолог белкам теплового шока, названный Hsc70-1 (Wu et al. 2011), и регулятор клеточного цикла циклин B в дополнение к двум защитным белкам хозяина. Гранулины имеют очень высокую гомологию последовательностей, и поэтому гранулин-2 не может быть новой находкой в бессимптомном исследовании. Однако Toll-подобный рецептор 22 (TLR-22) не был обнаружен в двух других анализах и, как было продемонстрировано, обладает противовирусной функцией (Lv et al. 2012).

Несколько регионов мира относительно свободны от вируса карпового герпеса, таких как Индия и Австралия (McColl et al., 2007; Rathore et al., 2009); однако CyHV-3 стал эпидемической угрозой для мировой карповой промышленности, особенно в Европе, Израиле, Индонезии и крупнейшем производителе карпа в аквакультуре, Китае. В нескольких исследованиях изучался метод заражения, латентность и обнаружение CyHV-3 (Bergmann et al. 2009, 2010; Costes et al. 2009). Однако относительно небольшое количество исследований изучало CyHV-3 на молекулярном уровне. Мы использовали очистку на основе антител к организму с последующим электрораспылительным ионизационным анализом для изучения молекулярных взаимодействий при заражении CyHV-3. В ходе этого исследования было идентифицировано семьдесят восемь эндогенных белков-хозяев наряду с пятью предполагаемыми иммуногенными белками CyHV-3, участвующими в репликации и распространении CyHV-3. Кроме того, четыре эндогенных белка были идентифицированы в образцах, полученных от рыб с бессимптомным течением CyHV-3. Недавно было показано, что инфекция CyHV-3 модулирует экспрессию генов в пути деградации протеасом, гранулина и других модифицирующих белок ферментов, идентифицированных в этом отчете. Антитело против гликопротеина (ORF56) смогло выделить белки CyHV-3 в образце, который был отрицательным по KHV, согласно методам ПЦР, выявляющим ген TK. Гликопротеин также может быть высокоиммуногенным и хорошей мишенью для выявления CyHV-3 у бессимптомных рыб методом ELISA или даже ПЦР-анализа. Разнообразие белков, идентифицированных в этом исследовании, открывает возможности для дальнейшего анализа белков-хозяев, участвующих в репликации, распространении и подавлении CyHV-3. Например, Toll-подобный рецептор 22, по-видимому, участвует в подавлении заболевания CyHV-3 у инфицированных рыб. Следовательно, стимуляция сверхэкспрессии TLR-22 может быть альтернативным методом борьбы с заболеванием CyHV-3.

25.03.2024
12

Продукция

Черно-пестрая порода коров

На территории России большое распространение с начала прошлого столетия получила черная (пестрая) порода коров, которая...

Черно-пестрая порода

На территории России большое распространение с начала прошлого столетия получила черная (пестрая) порода коров, которая...

Холмогорская порода коров

Холмогорская порода коров - вынослива; неприхотлива к условиям, в которых растет и к рациону питания. ...

Холмогорская порода коров

Холмогорская порода коров - вынослива; неприхотлива к условиям, в которых растет и к рациону питания. ...

Айрширская порода коров

Айрширская порода коров может давать в среднем 7 тысяч килограммов молока в год...

Вся продукция

Статьи партнеров

С Дастином мы поговорили про почвенный анализ, узнали что это такое, зачем он нужен, на что обращают внимание агрономы при получении этого анализа.

203

В феврале получили возможность познакомить вас ближе с Rock River Laboratory – нашими американскими партнёрами по исследованиям кормов и почвы. И сняли три интервью с разными сот...

215

Сенаж из люцерны является ценным источником питательных веществ для молочного стада. Повышение качества кормов за счет увеличения показателя TTNDFD по...

293

TMR Online – это простой и удобный калькулятор для расчёта полносмешанных рационов. Он позволяет бесплатно составить рацион кормления для крупного рог...

427

Микотоксины в кормосмеси: следим за опасным уровнем для КРС 44% образцов имели превышение хотя бы одного из пяти типов микотоксинов среди 255 кормосмесей, исследованных...

463

Анализ на антиген ВД КРС позволяет выявить персистентно-инфицированных животных, из-за которых вирус не уходит из стада, и приводит к дальнейшему заражению здоровых особей и их г...

487

Ветеринарный консультант лаборатории ЯРВЕТ поможет вам правильно выбрать животных, материал и время для исследования перед анализом, и окажет помощь в интерпретации результатов п...

529

Что такое de novo жирные кислоты, почему они важны для потребителей молочных продуктов и как они влияют на общую концентрацию молочного жира? Ниже пре...

563

Что такое de novo жирные кислоты, почему они важны для потребителей молочных продуктов и как они влияют на общую концентрацию молочного жира? Ниже пре...

650

Холин помогает коровам мобилизовать и переработать всплеск СЖК, возникающий после отела, снижая тяжесть жировой болезни печени (стеатоз). Холи...

748