Метод основан на способности фермента редуктазы, выделяемого микроорганизмами, обесцвечивать или восстанавливать краситель метиленовый синий или резазурин. Для выполнения анализа требуется редуктазник или термостат, пробирки диаметром 22 мм. резиновые пробки к ним, пипетки на 1,20 мл, 96%-ный этиловый спирт, метиленовый синий (МРТУ-6-09-29-76) или резазурии (ТУ-6-09-210-70) , дистиллированная вода. Перед анализом посуду и пробки кипятят в дистиллированной воде в течение 30 мин или хлорируют с последующим ополаскиванием прокипяченной водой.
Проба на редуктазу с метиленовым синим (табл. 1).
В стерильныe пробирки наливают по 1 мл рабочего раствора метиленового синего и по 20 мл исследуемого молока, закрывают пробками и смешивают медленным трехкратным переворачиванием пробирок. Пробирки помещают в редуктазник с температурой воды 380, чтобы уровень ее был немного выше уровня молока в пробирках, или ставят в химический стакан с водой температурой 380, помещенный в термостат. Время погружения пробирок в редуктазник или стакан с водой в термостат считают началом анализа. За изменением окраски наблюдают через 20 мин, через 2 ч, через 5,5 ч от начала анализа. Время обесцвечивания молока - окончание анализа. Остающееся около 1 см окрашенное кольцо вверху или внизу пробирки в расчет не принимается. Чем больше содержится микроорганизмов в молоке, тем быстрее обесцвечивается проба.
Приготовление раствора метиленового синего. 10 г метиленового синего смешивают со 100 мл 96 % -ного этилового спирта, закрывают плотно пробкой и выдерживают в термостате при 370 24 ч, затем фильтруют. Для приготовления рабочего раствора к 5 мл основиого профильтрованного раствора добавляют 195 мл дистиллированной воды и хорошо перемешивают. Срок хранения рабочего раствора не более 7 суток.
Проба на редуктазу с резазурином (ускоренная).
Таблица 1
Оценка качества молока по пробе на редуктазу
Продолжительность обесцвечивания |
Количество бактерий в 1 мл молока. |
Класс молока |
Оценка качества молока |
Свыше 5 час.30 мин |
Менее 500 тыс. |
1 |
Хорошее |
С 2 ч.до 5 часов 30 мин |
От 500 тыс. до 4 млн. |
II |
Удовлетворительное |
Свыше 20 мин. До 2 ч. |
От 4 млн. до 20 млн. |
III |
Плохое |
20 мин и менее |
20 млн. и выше. |
IV |
Очень плохое |
Приготовление раствора резазурина (табл. 2). Основной раствор - 100 мг резазурина, растворенного в 200 мл прокипяченной и охлажденной дистиллированной воды, следует хранить не более 20 суток при температуре 3-50. Рабочий раствор резазурина готовят из основного, разбавляя его прокипяченной и охлажденной дистиллированной водой в 10 раз. Например, 5 мл основного раствора вносят в мерную колбу на 50 мл и доводят до метки дистиллированной водой. Рабочий раствор содержит 0,005 % резазурина, срок хранения его не более 7 суток при температуре не выше 8-100. Основной и рабочий растворы резазурина хранят в склянках из темного стекла.
Таблица 2
Оценка качества молока по пробе на редуктазу с резазурином
Продолжительность изменения цвета |
Окраска молока |
Количество бактерий в 1 мл молока |
Класс молока |
Оценка качества молока |
Через 1 ч |
Сине - стальная |
Менее 500 тыс. |
1 |
Хорошее |
Через 1ч |
Сиреневая или сине-феолетовая |
от 500 тыс. до 4 млн. |
II |
Удовлетворительное |
Через 1 ч |
Розовая или белая |
От 4 млн. до 20 млн. |
III |
Плохое |
До 20 мин |
Белая |
Свыше 20 млн. |
IV |
Очень плохое |